本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出肌肉组织、饲料、尿液等样品中的莱克多巴胺含量。

三、交叉反应率

与类似物的交叉反应率：

莱克多巴胺…………………………………100%

沙丁安醇……………………………………﹤1%

盐酸多巴安………………………………﹤1%

克伦特罗 ………………………………﹤1%

四、试剂盒组成

酶标板1块，96孔/板

标准液5瓶（1 mL/瓶）：

0 ppb、0. 1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb

酶标记物  ………………………………………7mL

抗体工作液 ………………………………………10mL

底物液A ………………………………………7mL

底物液B………………………………………7mL

终止液……………………..…………………7mL

10×浓缩洗涤液………………………………40mL

2×浓缩复溶液………………………………50mL

说明书……………………..………………1份

五、使用单位需自备的设备及试剂

（1）仪器

微孔板酶标仪(450 nm)；氮气吹干装置；振荡器；离心机；涡旋仪；电子天平（感量0.01 g）。

（2）器材

容量瓶：100 mL，500 mL，1000 mL

单道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）试剂

甲醇、乙腈、正己烷、氢氧化钠、浓盐酸、去离子水

六、溶液的配制

样本前处理需配制：

配液1：1M  NaOH溶液

        称取4.0 g NaOH加去离子水溶解，定容至100 mL。

配液2：0.1M  HCl  

量取0.83 mL浓盐酸加入去离子水中定容至100 mL。

配液3：25%甲醇

       量取25mL甲醇，加入到75mL去离子水中，充分混匀。

配液4：25%甲醇-0.1MHCL溶液

量取20mL 0.1M 盐酸溶液加入到80mL 25%甲醇溶液中并充分混匀。     

配液5：样本复溶液

2×浓缩复溶液在使用前请按1：1稀释（1份浓缩样本复溶液+ 1份去离子水）。

配液6：洗涤工作液

10×浓缩洗涤液在使用前请按1：9稀释（1份浓缩洗涤液 + 9份去离子水）（可按需配置）。

七、样本前处理方法

样本处理前须知：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

    （2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤：

（A）组 织处理（鸡、鸭、猪肌肉/肝脏、鸡蛋、鱼、虾等）

处理方法一：

1、准确称取2.0±0.02 g匀浆样本于50 mL离心管中；

2、加入0.5mL稀释后的样本复溶液（配液5），充分振荡2min，加入8mL 乙腈，充分涡旋振荡3~5 min，室温4000 r/min离心10 min；

3、取2.5 mL上层液体至另一离心管中，50~60℃氮气吹干；

4、加入1 mL 正己烷溶解残余物，再加入1mL样本复溶液（配液5），充分混合30 s，室温4000 r/min离心10 min；

5、去除上层正己烷，取20 μL下层液用于分析。

处理方法二：

1、准确称取2.0±0.02 g匀浆样本于50 mL离心管中；

2、加入6mL25%甲醇-0.1MHCL溶液，振荡混匀3~5min，室温4000 r/min以上离心10 min（注：若组织样本中油脂含量较高，可在振荡后放入85℃水浴10min后再离心）；

3、取1 mL上层液体至另一2mL离心管中，加入20μL 1M氢氧化钠溶液并充分混匀（混匀以后测定pH值，大约为7-8）；

4、 4000 r/min离心3~5 min；取上清液20 μL用于分析。

（B）尿液、血清

     取20 μL清亮尿样或血清直接测定（如尿样或血清浑浊

     必须通过过滤或4000 r/min于15℃离心10 min 直至清

     亮），暂不使用的样本应冷冻保存。

八、酶联免疫检测步骤

测定前须知：

1、 使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。

2、 使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

3、 在使用中不要让微孔干燥。 

4、 在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

5、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

测定步骤：

1、 将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡30 min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。

2、 加标准品/样品：加入标准品/样品20 μL/孔，加入酶标记物50 μL/孔，再加入抗体工作液80 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖好，室温25℃下避光反应30 min。

3、 洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 250 μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗涤4~5次，用吸水纸拍干。

4、 显色：每孔先各加入底物液A 50 μL，再各加入底物液B 50 μL，轻轻振荡混匀，并在室温25℃下避光反应10~15 min。

5、 测定：每孔各加50 μL终止液，轻轻振荡混匀在酶标仪于450 nm处测定OD值（建议用450/630 nm双波长检测，在5 min内读完数据）。

九、结果分析

        所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以第 

     一个标准液（0标准液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，

     得到百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝

以标准品浓度的10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含莱克多巴胺的量。

利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

十、样本稀释倍数

动物组织：2倍（方法一）、4倍（方法二）

尿液、血清样品：1倍

十一、试剂盒灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度：0. 1ppb

样本检测限：

组织样品（方法一）…………………0.2ppb

组织样品（方法二）…………………0.4 ppb

尿液、血清样品………………………0.1ppb

回收率：

组织样品 …………………………75±20%

     尿液、血清样品………………………95±20%

精密度：试剂盒的变异系数均小于10%

十二、注意事项

1、室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20~25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

4、保存试剂盒于2~8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

5、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。

6、在加入底物液后，一般显色15 min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20 min（或更长），但不得超过30 min；反之，则减短反应时间。

十三、贮藏条件及保存期

贮藏条件：在2~8 ℃保存试剂盒。

保存期：本试剂盒有效期为12个月。